維生素C的測(cè)定
維生素C是一種已糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以被人們稱做抗壞血酸，主要為還原型及脫氫型兩種，廣泛存在于植物組織中，新鮮的水果、蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、柿子葉、獼猴桃、柑橘等食品中含量較多。它是氧化還原酶之一，本身易被氧化，但在有些條件下又是一種抗氧化劑。
維生素C(還原型)純品為白色無(wú)臭結(jié)晶，熔點(diǎn)190～192℃，溶于水或乙醇中，不溶于油劑。在水溶液中易被氧化，在堿性條件下易分解，在弱酸條件中較穩(wěn)定，維生素C開始氧化為脫氫型抗壞血酸(有生理作用)。如果進(jìn)一步水解則生成2，3-二酮古樂糖酸，失去生理作用。
根據(jù)它具有的還原性質(zhì)可以測(cè)定維生素C的含量。常用的測(cè)定方法有
(1)2，6-二氯靛酚法 (還原型VC)
(2)2，4-二硝基苯肼法 (總VC)
(3)碘酸法
(4)碘量法
(5)熒光分光光度法
一、2，6-二氯靛酚滴定法
1、原理：
還原型抗壞血酸還原染料2，6-二氯靛酚，該染料在酸性中呈紅色，被還原后紅色消失。還原型抗壞血酸還原2，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質(zhì)干擾時(shí)，一定量的樣品提取液還原標(biāo)準(zhǔn)2，6-二氯靛酚的量與樣品中所含維生素C的量成正比。
2、試劑
⑴ 1%草酸溶液：稱取10g草酸，加水至1000ml;
⑵ 2%草酸溶液：稱20g草酸，加水至1000ml;
⑶ 維生素C標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱20mgVC溶于1%草酸中，并稀釋至100ml，吸5ml于50ml容量瓶中，加入1%草酸至刻度，此溶液每毫升含有0.02mgVC;
⑷ 0.02%2，6-二氯靛酚溶液：稱取2，6-二氯靛酚50mg，溶于200ml含有52mg碳酸氫鈉的熱水中，冷卻后，稀釋至250ml，過濾于棕色瓶中，貯存于冰箱內(nèi)，應(yīng)用過程中每星期標(biāo)定一次。
標(biāo)定一：吸標(biāo)液(VC)5ml于三角瓶→加6%KI溶液0.5ml→加1%淀粉3滴→用0.001N KIO3標(biāo)液滴定到淡蘭色。
計(jì)算：
抗壞血酸濃度(mg/ml)= (V1 × 0.088)/ V2
V1 - 滴定時(shí)消耗0.001N KIO3標(biāo)液的體積(ml)
V2 -維生素C重量(g)
0.088 -1ml0.001N KIO3標(biāo)液≈維生素C的量(mg/ml)
標(biāo)定二：吸5ml已知濃度V C標(biāo)液 → 加5ml1%草酸 → 用染料2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉紅色，在15秒不褪色為終點(diǎn)
計(jì)算：每毫升2，6-二氯靛酚相當(dāng)于維生素C的毫克數(shù)等于滴定度(T)
T= (C × V1)/ V2
C - 維生素C的濃度(mg/ml)
V1 -維生素C的體積(ml)
V2 -消耗2，6-二氯靛酚的體積(ml)
⑸ 0.001N KIO3標(biāo)液：吸0.1N KIO3溶液5ml→于500ml容量瓶?jī)?nèi)→加水至刻度，每毫升相當(dāng)于VC0.008mg;
⑹ 0.5%淀粉溶液;
⑺ 6%KI溶液;
3、操作方法
⑴ 提?。悍Q樣50g→加2%草酸100ml→到入搗碎機(jī)中→處理→過濾→顏色若深可加白陶土
⑵ 滴定：吸5ml樣液→于三角瓶→用染料滴定至粉紅色→15秒內(nèi)不褪色
計(jì)算：
VC(mg/100g)=(V × T)/ W × 100
V -消耗染料體積(ml)
T -1ml染料所能氧化維生素C的毫克數(shù)
W- 滴定時(shí)所有濾液中含有樣品的克數(shù)
4、注意事項(xiàng)
⑴ 所有試劑的配制都用重蒸餾水;
⑵ 滴定時(shí)，可同時(shí)吸二個(gè)樣品。一個(gè)滴定，另一個(gè)作為觀察顏色變化的參考;
⑶ 樣品進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，損失維生素C;
⑷ 貯存過久的罐頭食品，可能含有大量的低鐵離子(Fe2+)，要用8%的醋酸代替2%草酸。這時(shí)如用草酸，低鐵離子可以還原2，6-二氯靛酚，使測(cè)定數(shù)字增高，使用醋酸可以避免這種情況的發(fā)生;
⑸ 整個(gè)操作過程中要迅速，避免還原型抗壞血酸被氧化;
⑹ 在處理各種樣品時(shí)，如遇有泡沫產(chǎn)生，可加入數(shù)滴辛醇消除;
⑺ 測(cè)定樣液時(shí)，需做空白對(duì)照，樣液滴定體積扣除空白體積。
二、2，4-二硝基苯肼法
可測(cè)總抗壞血酸，總抗壞血酸包括還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸型。此法是將樣品的還原型抗壞血酸氧化為脫氫型抗壞血酸，然后與2，4-二硝基苯肼作用，生成紅色的脎。脎的量與總抗壞血酸含量成正比，將紅色脎溶于硫酸后進(jìn)行比色，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總VC。
1、原理：
用酸處理過的活性碳把還原型的抗壞血酸氧化為脫氫型抗壞血酸，在繼續(xù)氧化為二酮古樂糖酸。
二酮古樂糖酸與2，4-二硝基苯肼偶聯(lián)生成紅色的脎，其成色的強(qiáng)度與二酮古樂糖酸濃度呈正
比，可以比色定量。
2、步驟
⑴ 樣品處理與分析
稱一定樣 → 加等量2%草酸 → 于高速搗碎機(jī)搗碎 → 取勻漿20g → 用1%草酸定容100ml → 過濾 → 取濾液10ml → 加1%草酸10ml → 加少量活性炭 → 搖1分鐘 → 靜置過濾 → 各取濾液2ml于樣品管和樣品空白管 → 各管加入1滴硫脲溶液 → 于樣品管中加入2，4-二硝基苯肼0.5ml → 分別于兩個(gè)管加蓋 → 于37℃保溫箱3小時(shí) → 取出后樣品管放入冰水中 → 樣品空白管取出后冷至室溫 → 在樣品空白管加入2，4-二硝基苯肼 → 0.5ml → 樣品管和空白管都于冰浴中 → 滴加85%H2SO42ml于各管中 → 邊滴邊搖 → 防止溫度升高炭化后呈黑色 → 冰浴中30分鐘后取出 → 室溫下放置30分鐘后，在540nm測(cè)消光值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的含量
⑵ 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
取5個(gè)50ml容量瓶編號(hào) 1 2 3 4 5
加VC標(biāo)液0.2mg/ml 10 20 30 40 50ml
取5個(gè)比色管取相應(yīng) 2 2 2 2 2
加硫脲溶液(滴) 1 1 1 1 1
2，4-二硝基苯肼(ml)0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
于37℃保溫箱3～4小時(shí)，取出于冰浴中，然后滴加85%硫酸2.5ml→取出放30分鐘→在540nm下測(cè)各消光值繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)做空白。
計(jì)算：每百克食品中抗壞血酸的毫克數(shù)=C/W *100
維生素C是一種已糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以被人們稱做抗壞血酸，主要為還原型及脫氫型兩種，廣泛存在于植物組織中，新鮮的水果、蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、柿子葉、獼猴桃、柑橘等食品中含量較多。它是氧化還原酶之一，本身易被氧化，但在有些條件下又是一種抗氧化劑。
維生素C(還原型)純品為白色無(wú)臭結(jié)晶，熔點(diǎn)190～192℃，溶于水或乙醇中，不溶于油劑。在水溶液中易被氧化，在堿性條件下易分解，在弱酸條件中較穩(wěn)定，維生素C開始氧化為脫氫型抗壞血酸(有生理作用)。如果進(jìn)一步水解則生成2，3-二酮古樂糖酸，失去生理作用。
根據(jù)它具有的還原性質(zhì)可以測(cè)定維生素C的含量。常用的測(cè)定方法有
(1)2，6-二氯靛酚法 (還原型VC)
(2)2，4-二硝基苯肼法 (總VC)
(3)碘酸法
(4)碘量法
(5)熒光分光光度法
一、2，6-二氯靛酚滴定法
1、原理：
還原型抗壞血酸還原染料2，6-二氯靛酚，該染料在酸性中呈紅色，被還原后紅色消失。還原型抗壞血酸還原2，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質(zhì)干擾時(shí)，一定量的樣品提取液還原標(biāo)準(zhǔn)2，6-二氯靛酚的量與樣品中所含維生素C的量成正比。
2、試劑
⑴ 1%草酸溶液：稱取10g草酸，加水至1000ml;
⑵ 2%草酸溶液：稱20g草酸，加水至1000ml;
⑶ 維生素C標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱20mgVC溶于1%草酸中，并稀釋至100ml，吸5ml于50ml容量瓶中，加入1%草酸至刻度，此溶液每毫升含有0.02mgVC;
⑷ 0.02%2，6-二氯靛酚溶液：稱取2，6-二氯靛酚50mg，溶于200ml含有52mg碳酸氫鈉的熱水中，冷卻后，稀釋至250ml，過濾于棕色瓶中，貯存于冰箱內(nèi)，應(yīng)用過程中每星期標(biāo)定一次。
標(biāo)定一：吸標(biāo)液(VC)5ml于三角瓶→加6%KI溶液0.5ml→加1%淀粉3滴→用0.001N KIO3標(biāo)液滴定到淡蘭色。
計(jì)算：
抗壞血酸濃度(mg/ml)= (V1 × 0.088)/ V2
V1 - 滴定時(shí)消耗0.001N KIO3標(biāo)液的體積(ml)
V2 -維生素C重量(g)
0.088 -1ml0.001N KIO3標(biāo)液≈維生素C的量(mg/ml)
標(biāo)定二：吸5ml已知濃度V C標(biāo)液 → 加5ml1%草酸 → 用染料2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉紅色，在15秒不褪色為終點(diǎn)
計(jì)算：每毫升2，6-二氯靛酚相當(dāng)于維生素C的毫克數(shù)等于滴定度(T)
T= (C × V1)/ V2
C - 維生素C的濃度(mg/ml)
V1 -維生素C的體積(ml)
V2 -消耗2，6-二氯靛酚的體積(ml)
⑸ 0.001N KIO3標(biāo)液：吸0.1N KIO3溶液5ml→于500ml容量瓶?jī)?nèi)→加水至刻度，每毫升相當(dāng)于VC0.008mg;
⑹ 0.5%淀粉溶液;
⑺ 6%KI溶液;
3、操作方法
⑴ 提?。悍Q樣50g→加2%草酸100ml→到入搗碎機(jī)中→處理→過濾→顏色若深可加白陶土
⑵ 滴定：吸5ml樣液→于三角瓶→用染料滴定至粉紅色→15秒內(nèi)不褪色
計(jì)算：
VC(mg/100g)=(V × T)/ W × 100
V -消耗染料體積(ml)
T -1ml染料所能氧化維生素C的毫克數(shù)
W- 滴定時(shí)所有濾液中含有樣品的克數(shù)
4、注意事項(xiàng)
⑴ 所有試劑的配制都用重蒸餾水;
⑵ 滴定時(shí)，可同時(shí)吸二個(gè)樣品。一個(gè)滴定，另一個(gè)作為觀察顏色變化的參考;
⑶ 樣品進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，損失維生素C;
⑷ 貯存過久的罐頭食品，可能含有大量的低鐵離子(Fe2+)，要用8%的醋酸代替2%草酸。這時(shí)如用草酸，低鐵離子可以還原2，6-二氯靛酚，使測(cè)定數(shù)字增高，使用醋酸可以避免這種情況的發(fā)生;
⑸ 整個(gè)操作過程中要迅速，避免還原型抗壞血酸被氧化;
⑹ 在處理各種樣品時(shí)，如遇有泡沫產(chǎn)生，可加入數(shù)滴辛醇消除;
⑺ 測(cè)定樣液時(shí)，需做空白對(duì)照，樣液滴定體積扣除空白體積。
二、2，4-二硝基苯肼法
可測(cè)總抗壞血酸，總抗壞血酸包括還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸型。此法是將樣品的還原型抗壞血酸氧化為脫氫型抗壞血酸，然后與2，4-二硝基苯肼作用，生成紅色的脎。脎的量與總抗壞血酸含量成正比，將紅色脎溶于硫酸后進(jìn)行比色，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總VC。
1、原理：
用酸處理過的活性碳把還原型的抗壞血酸氧化為脫氫型抗壞血酸，在繼續(xù)氧化為二酮古樂糖酸。
二酮古樂糖酸與2，4-二硝基苯肼偶聯(lián)生成紅色的脎，其成色的強(qiáng)度與二酮古樂糖酸濃度呈正
比，可以比色定量。
2、步驟
⑴ 樣品處理與分析
稱一定樣 → 加等量2%草酸 → 于高速搗碎機(jī)搗碎 → 取勻漿20g → 用1%草酸定容100ml → 過濾 → 取濾液10ml → 加1%草酸10ml → 加少量活性炭 → 搖1分鐘 → 靜置過濾 → 各取濾液2ml于樣品管和樣品空白管 → 各管加入1滴硫脲溶液 → 于樣品管中加入2，4-二硝基苯肼0.5ml → 分別于兩個(gè)管加蓋 → 于37℃保溫箱3小時(shí) → 取出后樣品管放入冰水中 → 樣品空白管取出后冷至室溫 → 在樣品空白管加入2，4-二硝基苯肼 → 0.5ml → 樣品管和空白管都于冰浴中 → 滴加85%H2SO42ml于各管中 → 邊滴邊搖 → 防止溫度升高炭化后呈黑色 → 冰浴中30分鐘后取出 → 室溫下放置30分鐘后，在540nm測(cè)消光值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的含量
⑵ 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
取5個(gè)50ml容量瓶編號(hào) 1 2 3 4 5
加VC標(biāo)液0.2mg/ml 10 20 30 40 50ml
取5個(gè)比色管取相應(yīng) 2 2 2 2 2
加硫脲溶液(滴) 1 1 1 1 1
2，4-二硝基苯肼(ml)0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
于37℃保溫箱3～4小時(shí)，取出于冰浴中，然后滴加85%硫酸2.5ml→取出放30分鐘→在540nm下測(cè)各消光值繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)做空白。
計(jì)算：每百克食品中抗壞血酸的毫克數(shù)=C/W *100